寄生虫病
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韩国国立首尔大学蔡昌熙教授:使用“通灭”驱虫后可以提高免疫“克伟”猪只的抗体水平!

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专家简介:蔡昌熙,博士,毕业于韩国国立首尔大学,现为韩国国立首尔大学兽医学院教授。

经产母猪联合使用“克伟”和“通灭”对支气管败血波氏杆菌和多杀性巴氏杆菌血清学反应的效力研究

寄生会对免疫反应产生负面影响。虽然一些类型的寄生在免疫学上会刺激Th2细胞,可以加强抗体的产生,但通过对寄生的治疗以改善健康状况会对抗体的产生有积极影响。根据一项研究推测,使用“通灭”驱虫后会使沙门氏菌疫苗产生的抗体数量增加(Ishikawa, et al, 2000)。

本试验旨在研究使用“通灭”驱虫后是否可以使“克伟”免疫猪只后产生更好的抗体水平。

试验目的

为了证明后备母猪/经产母猪使用“通灭”驱虫后再免疫“克伟”比不驱虫免疫“克伟”能提供对支气管败血波氏杆菌和多杀性巴氏杆菌更好的抗体反应。

试验动物

后备母猪或者经产母猪。每头怀孕母猪将用耳标或其他字母-数字方法(如耳缺或者清晰的纹身)单独标记。

试验前处理/特别考虑

试验后备母猪/经产母猪必须有疥螨感染,而且最好也有胃肠线虫感染。后备母猪/经产母猪之前未免疫支气管败血波氏杆菌和/或多杀性巴氏杆菌抗原。

试验场地描述/标准

试验场地环境条件要求试验动物试验期间不会受到支气管败血波氏杆菌和多杀性巴氏杆菌流行毒株的自然感染。

试验动物管理

①猪舍:有限的混凝土猪舍,1200头后备母猪/经产母猪。②商业饲料:农标普瑞纳,韩国。③水源:天然水。④环境控制:符合韩国养猪标准。

接种物/攻毒感染

自然感染疥螨。最好自然感染胃肠线虫,例如:兰氏类圆线虫、有齿节线虫、猪蛔虫以及/或者猪鞭虫。

试验设计

试验组

剂量

用药方案

给药途径

每个试验组动物头数

 试验组1

 克伟+通灭

2mL/头+

0.03mL/千克

 

1天1次,分娩前42天和分娩前14天+1天1次,分娩前70天和分娩前35天

 

肌肉注射+

肌肉注射

³ 20

试验组2

克伟

2mL/

 

1天1次,分娩前42天和分娩前14天

 

肌肉注射

³ 20

备注:免疫/注射日期将根据预测的分娩日期确定,0天是指每头猪只实际的分娩日期。

试验程序

1、 试验动物入选标准

试验动物必须是被确认怀孕而且有中度到重度疥螨临床症状的后备母猪/经产母猪。至少40头怀孕母猪逐步加入试验。所有动物不要同时加入。在分娩前70天,在加入试验前,兽医将通过观察疥螨症状在临床上评估候选后备母猪/经产母猪,并且将根据标准对疥螨皮肤损伤评分(Saeki, et al., 1997)。有中度到重度疥螨临床症状的后备母猪/经产母猪将被选入试验。

2、试验动物排除标准

下述动物不能被选为试验动物:①后备母猪/经产母猪之前已经免疫过支气管败血波氏杆菌和多杀性巴氏杆菌抗原。②后备母猪/经产母猪有临床异常包括有萎缩性鼻炎症状(如歪鼻子、短颌),排除疥螨和胃肠线虫感染。③后备母猪/经产母猪对之前的颈部注射有不良反应现象。④后备母猪/经产母猪有明显的营养失调。⑤正在治疗的或者刚患病康复的后备母猪/经产母猪。

3、试验动物在分娩前70天,入选试验后,从每头猪只采取下列样本

①至少5ml全血以备血清学检测。②在耳垂、颈或四肢刮下损伤面积大约2cm ╳ 2cm大小的皮肤碎屑进行疥螨检查。③从直肠至少采集10g粪便进行粪便虫卵计数。

4、试验动物分组

有相同皮肤损伤评分的猪只将配对并随机分配到试验组1或试验组2。饲养和配种管理在试验中保持类似。猪只中多杀性巴氏杆菌血液抗体滴度超过16倍或支气管败血波氏杆菌血液抗体滴度超过64倍将被剔除试验,然后再无进一步的试验程序处理。

5、试验动物注射“通灭”或/和“克伟

根据试验设计,试验组1的动物将分别在分娩前70天和分娩前35天注射“通灭”, 同时试验组1和试验组2都将分别在分娩前42天和分娩前14天免疫“克伟”。试验产品将在颈外侧中线、耳根部肌肉注射,第一次在左颈注射,第二次在右颈注射。每头猪用单独的无菌18号针头注射试验产品。

6、试验动物进行血清学检测

所有试验猪只分别在分娩前70天、42天、14天、0天至少采取5ml全血进行血清学检测。

7、试验动物进行疥螨皮肤损伤评分

所有试验猪只分别在分娩前70天、35天、0天进行疥螨皮肤损伤评分。

8、试验动物进行疥螨检查

所有试验猪只分别在分娩前70天和0天对收集的皮肤刮屑(损伤面积大约2cm ╳ 2cm大小)进行疥螨检查。

9、试验动物进行粪便虫卵计数

所有试验猪只分别在分娩前70天、0天至少采集直肠粪便10g进行粪便虫卵计数。

10、试验动物免疫支气管败血波氏杆菌和/或多杀性巴氏杆菌抗原

直到最后的血液校正日期,试验猪只才会免疫支气管败血波氏杆菌和/或多杀性巴氏杆菌抗原。

疥螨皮肤损伤评分标准

分值

皮肤损伤

  0

无损伤

  1

轻微:无角化过的疥螨损伤,但有轻微结痂、

剥落或红斑

2

中度:有局部中等厚度干燥灰白色硬壳的损伤

3

重度:有大、厚、浅灰色、粗糙、干燥硬壳的

合并损伤

疥螨检查 

在待刮的皮肤区域抹上矿物油后,用凿子一直刮到毛细血管层。收集刮下的皮屑,置于离心管并用5ml 10%氢氧化钾消化过夜。第二天,以每分钟2500转离心15分钟后,将几滴上清液移入其他容器。加入5ml 10%的氢氧化钾使沉淀物悬浮,然后转移到培养皿。疥螨包括成虫、若虫和幼虫,并且在倒置生物显微镜下进行疥螨虫卵计数。

粪便虫卵计数

使用糖离心漂浮技术,对每克粪便的虫卵计数。虫卵将在形态学上被识别出线虫种类。比如:兰氏类圆线虫、有齿节线虫、猪蛔虫以及/或者猪鞭虫。同时对每克粪便每个种类虫卵计数。

血清学检查

利用胎牛肺细胞(EBL)培养检验血清多杀性巴氏杆菌抗毒素滴度,滴度将以血清最高稀释度的倒数表示。显示当每0.05mL毒素使用8 EBL单位时,完全没有细胞病理学效应(比如: 如果使用2倍稀释:<2、2、4、8、16 等等)。血清也会被检测支气管败血波氏杆菌第一阶段凝集抗体滴度。滴度将以最高血清稀释度的倒数表示,显示完全凝集(比如:如果使用2倍稀释,<2、2、4、8、16等等)。

血清检测前将贮存在-25℃—-30℃条件下。负责血清检测的人员不知道试验动物的身份和窝信息。

试验数据分析

研究人员负责随机分配试验动物和随机选择试验动物做血清学检测。每一试验组、每个检测日计算多杀性巴氏杆菌和支气管败血波氏杆菌抗体滴定的几何平均值和几何标准差。每个检测日将对2个试验组的抗体滴定数据做统计比较。

对于血清学数据,利用配对t检验检测试验组1和试验组2在不同时间点的多杀性巴氏杆菌抗毒素滴度和支气管败血波氏杆菌凝集素滴度差异。利用单因子变异数分析检验在不同时间点组中多杀性巴氏杆菌抗毒素滴度和支气管败血波氏杆菌凝集素滴度的增长差异(P <0.05 即差异显著)。

试验结果

1、注射后临床不良反应

怀孕母猪注射“克伟”和/或“通灭”后没有观察到不良反应。

2、疥螨皮肤损伤评分

试验组1的经产母猪(使用“克伟”和“通灭”)和试验组2的经产母猪(仅使用“克伟”)有中度到重度疥螨皮肤损伤分数。试验组1疥螨皮肤损伤平均分为2.8。试验组2疥螨皮肤损伤平均分为2.75。试验组1疥螨皮肤损伤平均分在试验结束时下降到0.55,然而试验组2疥螨皮肤损伤平均分在试验结束时没有变化,依然为2.6(表1)。

表1 使用/不使用“通灭”免疫“克伟”后母猪疥螨皮肤损伤评分

组别

评分

试验时间

-70

-35

-14

0

皮肤损伤

皮肤损伤

皮肤损伤

皮肤损伤

  试验组1

0



3

9

1


7

15

11

2

4

11

2


3

16

2



总计


20

20

20

20

  试验组2

0





1





2

5

6

6

8

3

15

14

14

12

总计


20

20

20

20

注:试验组1,“克伟”+“通灭”;试验组2,“克伟” 。

3、疥螨检查

试验前(处理前),在试验组1,20头经产母猪中有4头分离到了疥螨。4个阳性皮屑有3个被评定为有少量的螨虫(<5个螨虫),1个被评定为有大量螨虫(>25个螨虫)。在试验组2,20头经产母猪中有3头分离到了疥螨。3头阳性经产母猪被评定为有少量螨虫(<5个螨虫)。试验处理后,没有从试验组1的20头经产母猪皮屑中分离到螨虫,然而在试验组2的20头经产母猪中,有3头分离到了螨虫。

4、粪便虫卵计数

在试验组1和试验组2经产母猪试验前,使用显微镜检查2个试验组的猪蛔虫、鞭虫和有齿食道口线虫的粪便虫卵(表2)。与试验组2相比,试验组1在处理后35天上述3种虫卵的计数是下降的(表2)。

表2 使用/不使用“通灭”免疫“克伟”后母猪粪便虫卵计数

组别

评分

试验时间

-70

-35

-14

0

A

O

T

A+O

总计

A

O

T

A+O

总计

A

O

T

A+O

总计

A

O

T

A+O

总计

  试验组1

0










9





9





7

1

8

7


3

12

7

5


1

11

6

5



11

8

5



13

2

4

5


2

7
















3

1

1


1

1
















 

 


11

14


5

20

11

14

1

6

20

11

13

1

4

20

12

12

1

5

20

  试验组2

0





















1

8

9


3

14

7

9

1

3

14

7

8

1

3

13

8

9

1

4

14

2

3

4


2

5

4

5


3

6

3

5


1

7

3

4


1

6

3


1



1
















总总

 


13

13


6

20

7

5


1

20

6

5



20

8

5



20

注:试验组1,“克伟”+“通灭”;试验组2,“克伟”;

A:Ascaris suum,蛔虫;T:Trichuris suis,鞭虫;O:Oesophagostomum dentatum,结节虫;A+O:Ascaris suum and Oesophagostomum dendatum,蛔虫和结节虫;

评分标准(阳性母猪每克粪便虫卵数):0分,无虫卵;1分,<50;2分,50-200;3分,>200。

5、血清学检测多杀性巴氏杆菌抗毒素滴度

在第二次免疫前(分娩前35天)和第二次免疫后14天(分娩当天,0天),试验组1和试验组2经产母猪的多杀性巴氏杆菌抗毒素滴度已经增加(表3)。试验组1和试验组2在分娩前70天和分娩前42天差异不显著(P>0.05)。试验组1和试验组2在分娩前35天、14天、0天差异显著(P = 0.01, P=0.0038, P=0.013),见表4。

表3 使用/不使用“通灭”免疫“克伟”后母猪多杀性巴氏杆菌抗毒素滴度

组别

滴度

试验时间

-70

-42

-35

-14

0

 

 

试验组1

<4

15

15




8

5

5




16






32



5

6

1

64



9

8

3

128 >



6

6

16

总计


20

20

20

20

20

 

 

试验组2

<4

15

16




8

5

4




16



5

5

2

32



6

7

4

64



7

7

5

128 >



2

1

9

总计


20

20

20

20

20

注:试验组1,“克伟”+“通灭”;试验组2,“克伟”。

表4 母猪多杀性巴氏杆菌抗毒素滴度几何平均值

组别

动物数量

试验时间

-70

-42

-35

-14

0

  试验组1

20

4.76

4.76

66.3

64.1

108

  试验组2

20

4.76

4.59

39.4

36.8

66.3

P


P=0.5

P=0.358

P=0.01

P=0.0038

P=0.013

注:试验组1,“克伟”+“通灭”;试验组2,“克伟”。

6、血清学检测支气管败血波氏杆菌凝集素滴度

在第二次免疫前(分娩前35天)和第二次免疫后14天(分娩当天,0天),试验组1和试验组2经产母猪的支气管败血波氏杆菌凝集素滴度已经增加(表5)。试验组1和试验组2在分娩前70和分娩前42天差异不显著(P>0.05)。试验组1和试验组2在分娩前35天、14天、0天差异显著(P=0.0022, P=0.0022, P=0.0038),见表6。

表5 免疫后母猪支气管败血波氏杆菌凝集素滴度

组别

滴度

试验时间

-70

-42

-35

-14

0

 

 

 

试验组1

<16

16

15




32

4

5




64






128






256






512



2

3


1024>



18

17

20

总计


20

20

20

20

20

 

 

 

试验组2

<16

15

15




32

5

5




64






128






256



3

3

1

512



7

8

6

1024>



10

9

13

总计


20

20

20

20

20

注:试验组1,“克伟”+“通灭”;试验组2,“克伟”。

表6 母猪支气管败血波氏杆菌凝集素滴度几何平均值

组别

动物数量

试验时间

-70

-42

-35

-14

0

  试验组1

20

18.4

19.4

955

923

1024

  试验组2

20

19

19

653

630

776

P


P=0.289

P=0.5

P=0.0022

P=0.0022

P=0.0038

注:试验组1,“克伟”+“通灭”;试验组2,“克伟”。

试验结论

与不驱虫的母猪相比,使用“通灭”驱虫后可以使免疫“克伟”的猪只产生更高的抗体滴度。

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