猪蓝耳病
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PRRSV灭活疫苗免疫效力探讨

猪蓝耳病自1987年在美国暴发后至今,已经成为危害世界养猪业最重要的疾病之一。我国作为世界上最大的养猪和猪肉生产国,受PRRS的影响尤为严重。疫苗免疫是防控PRRSV的重要措施,但是一直以来饱受争议。近年来由于PRRSV基因高度变异和重组演化的特性,使得猪场PRRSV毒株越来越多样化,PRRSV MLV受到质疑,国内猪场又开始尝试PRRS灭活疫苗免疫。


本文主要根据灭活疫苗的免疫机理、效力评价指标以及文献报道的数据来探讨PRRS灭活疫苗免疫的效力,希望为猪场科学选择和使用PRRS疫苗提供有力依据。


1 PRRS灭活疫苗免疫效力评价


目前评价PRRS疫苗效力主要依靠免疫攻毒保护试验,辅助的评价试验包括抗体和细胞因子评价试验(田克恭等,2010)。中和抗体曾被认为是评价PRRS疫苗免疫效果的重要指标,有学者报道它能保护猪抵御PRRSV的攻击。Joo等(2004)对中和抗体阳性和阴性猪进行攻毒试验,阴性猪出现病毒血症,而阳性猪没有出现。Osorio等(2002)给怀孕母猪注射中和抗体,注射猪攻毒后所有怀孕母猪都十分健康,未出现繁殖障碍问题,在血清中也未能检测到PRRSV。也有学者对中和抗体的作用提出了质疑,Zuckermann等(2007)的试验结果表明弱毒疫苗(Pyrsvac-183)产生的中和抗体滴度不高,但可以提供很好的保护作用;而灭活疫苗(Progressis®)可以刺激猪体产生较高水平的中和抗体,却不能保护猪体免受PRRSV的攻击;Nilubol等(2004)发现阳性猪接种某公司的PRRomiSe®灭活疫苗后产生较高水平的中和抗体,但不能抵御PRRS强毒株的攻击。Lopez等(2007)研究结果表明仔猪中和抗体滴度达到1:32才能完全保护,免于PRRSV感染。目前人们逐步把目光转移到IFN-γ和细胞因子类,但它们与免疫保护之间的相关性仍不可靠,Nilubol认为IFN-γ的升高很可能是受免疫佐剂的影响,属于非特异性免疫。


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PRRSV的感染可分为两个阶段,即早期感染期和持续性感染期。病毒要完全被清除需要150天或更长的时间(Allende等,2000)。目前对其真正的感染机制还不清楚。病毒感染7~9天后,机体内可检测到高水平的特异性抗体,但这些抗体不具有中和活性;中和抗体要在病毒感染4周左右才能产生,且效价较低(Meier等,2003)。由于中和抗体产生较晚且不规则,因此在PRRSV的保护性免疫中没有发挥太大的作用。此外,关于中和抗体的作用还存在争议。PRRSV持续性感染过程中,扁桃体等组织中存在较高滴度的病毒,而此时血清中有较高水平的中和抗体,因此认为中和抗体清除病毒的能力有限(Murtaugh M P.等,2002)。

Helenius A.等(2004)研究发现,PRRSV GP5蛋白上N-糖基化作用对病毒的正确组装、靶向作用及生物学活性均起着重要作用。PRRSV GP5蛋白上的糖基化在逃避机体免疫或降低机体产生特异性中和抗体方面发挥着重要作用(Johnson W E.等,2003)。病毒主要的中和作用决定子位于GP5蛋白上的N端外功能区,而这个蛋白上的一些特性,如“诱骗”表位和异质的糖基化作用隐藏了关键性中和作用位点,从而阻碍或降低了机体对病毒GP5蛋白上中和表位的体液免疫反应。这种N端聚糖遮蔽中和作用的特点在同属的LDV上也被观察到,被认为是病毒免疫逃避及形成持续性感染的主要机制之一(Lee C M.等,2003;Reitter J N.等,1998)。

PRRS灭活疫苗产生的免疫主要为体液免疫,诱导细胞免疫的能力低,导致免疫效果不理想不能有效清除感染猪体内的病毒,常导致免疫失败。此外,灭活苗还有免疫剂量大,需多次接种等缺点(Meng X J.等,2000)。

2 PRRS灭活疫苗对不同猪群的免疫效力


2.1 PRRS灭活疫苗对母猪的免疫效力


众多学者研究了PRRSV灭活苗对妊娠母猪的保护效力,Karniychuk U U.等(2012)通过用PRRSV灭活苗多次接种妊娠母猪,然后用同源毒攻毒来评估灭活苗效力。具体做法是使用某PRRSV毒株制备灭活疫苗,在后备母猪怀孕期27、55和83天免疫3次(试验组和对照组各3头,分别为试验1、2、3组和对照1、2、3组,试验组免疫该灭活疫苗,对照未免疫该灭活疫苗),在怀孕期90天时,试验组和对照组的后备母猪使用该PRRSV毒株活毒通过鼻内接种攻毒(剂量为105 TCID50),攻毒后20天安乐死所有后备母猪并采样。检测了疫苗免疫后和攻毒后血清中和抗体(图2-1)以及攻毒后血清PRRSV病毒载量(图2-2)。


结果显示:试验组和对照组在攻毒前中和抗体滴度都很低,攻毒后试验组有所升高,但是对照没有变化。对照组和试验组病毒载量差异不明显。结果还显示:胚胎木乃伊比例,试验组和对照组分别为8%和15%;胚胎着床位置有严重显微病理病变的比例,试验组和对照组分别为19%和45%(P<0.05);胎儿PRRSV阳性的比例,试验组和对照组分别为57%和75%。


上述结果说明虽然试验组有些指标在一定程度上比未免疫的对照组要好,但PRRSV对已经接种3次该同源毒灭活苗的后备母猪的影响仍然较为严重,该灭活苗效力有限。


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图2-1 疫苗接种和攻毒前后试验组与对照组各后备母猪血清中和抗体滴度的变化

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图2-2 攻毒后试验组和对照组各后备母猪血清中PRRSV滴度

由于以前的研究结果显示单独用PRRSV灭活苗免疫妊娠母猪,甚至多次免疫,都没有得到良好的保护,Andrew R K.等(2021)研究了PRRSV MLV和PRRSV灭活苗联合免疫的效果。具体做法是用基因2型PRRSV MLV免疫后备母猪,然后用两个不同公司生产的PRRSV 1-7-4灭活疫苗分别加强免疫4次。试验分组:试验1组(免疫MLV),试验2组(免疫MLV+4次灭活疫苗1),试验3组(免疫MLV+4次灭活疫苗2)(最后每个试验组选取了3头后备母猪的仔猪进行攻毒)。后备母猪分娩的仔猪在2周龄时用PRRSV 1-7-4毒株攻毒,攻毒后4周安乐死并采样检测。中和抗体(NA)滴度结果显示:试验1组没有针对同源毒株PRRSV 1-7-4的中和抗体,试验2组达到1:128,试验3组中和抗体滴度达到1:16(图2-3 A);而且母源血清中和抗体可以传递给其分娩的仔猪(图2-3 B、图2-3C),不同组仔猪之间血清中中和抗体差异极其显著(P<0.0001)(图2-3 B)。仔猪攻毒后病毒血症结果显示:虽然每组都有病毒血症,但是试验2组比试验3组和试验1组都低,差异极显著(P<0.01)(图2-4 A)。攻毒后4周的增重结果显示试验2组最好(图2-4 B)。肺脏大体病变和间质肺炎组织学评分试验2组最好(图2-4 C、D)。

本试验结果显示后备母猪免疫PRRSV MLV后使用灭活疫苗加强免疫可以促进免疫反应,提高中和抗体滴度,而且母源中和抗体可以传递给后代仔猪,对于同源毒株的攻毒可以提供部分保护,保护不完全,试验组感染后4周都还有病毒血症,而且肺脏大体病变和显微病变都存在,同时,也可以看出来不同厂家生产的同一毒株的灭活疫苗效果存在差异,灭活疫苗1效果要优于灭活疫苗2。

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图2-3 自家灭活疫苗加强免疫可以诱导同源毒株的中和抗体并传递给仔猪

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图2-4 仔猪攻毒后病毒血症、增重和肺脏大体病变以及组织病理学得分


许多学者对PRRSV灭活苗免疫母猪的田间实际效力展开了研究,Papatsiros V G.等(2006)报道了在一个母猪存栏1100头PRRSV呈地方性流行的猪场,使用某商品化的PRRS灭活疫苗,长期统计生产数据改善情况。该场母猪和后备母猪使用某灭活疫苗免疫2次,中间间隔3-4周,然后下个怀孕阶段50-60天时加强免疫1次。结果显示:疫苗接种的作用从第一次免疫接种似乎已经显现,对于大多数繁殖参数(流产、早产、断配间隔)和大多数窝产参数(木乃伊、低体重、弱仔、八字腿和断奶猪数量)均有改善(P<0.05)。其它参数如:返情、空怀、分娩率和活产仔数,疫苗免疫的积极作用从第二次加强免疫开始越来越明显(P<0.05)(表2-1)。


表2-1 母猪群持续使用某PRRSV灭活疫苗对繁殖性能和窝产特性的影响

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但是,进一步分析发现:该场5年前暴发过PRRS,每年有一些慢性PRRS表现;而且该场是以闭群和全进全出方式生产;另外,该灭活疫苗和猪场流行毒株的同源性较高。再加上该研究没有设空白对照组,该场生产水平的持续改善是否只和该灭活苗或其疾病背景及生产方式有关,还是疫苗和疾病背景及生产方式的共同作用结果,很难得到确切的答案,更不能得出灭活疫苗能产生有效保护的普遍结论。


综上所述,PRRS灭活疫苗免疫母猪,如果是PRRSV阴性猪则中和抗体滴度一般较低,如果是感染过PRRSV或者免疫过PRRSV MLV则中和抗体滴度可能会明显提升。免疫灭活疫苗的母猪在受到PRRSV病毒攻击的时候繁殖失败一样会比较明显,母源中和抗体传递给后代仔猪只能提供部分保护,病毒血症持续时间较长,组织发生病变,不能有效预防PRRSV感染。


2.2 PRRSV灭活疫苗对仔猪或生长育肥猪的免疫效力


Zuckermann F A .等(2007)使用某商品化的弱毒疫苗(PRRSV MLV)和某灭活疫苗分别免疫5月龄猪,首次接种疫苗时间为D0天,免疫28天后(D28)用105.0TCID50 PRRSV(Lelystad)攻毒,D42天安乐死试验猪,结束试验,具体分组和各项工作见表2-2。


表2-2 实验分组设计

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*表示剖检时采集的样本


结果显示:1)攻毒4天(D4)以后至试验结束时(D42),试验1组没有测到病毒血症,而试验2组和试验3组(对照组)均有明显的病毒血症,且两组间差异不显著(图2-5);2)试验结束时,PCR检测试验猪肺和扁桃体,试验1组、试验2组和试验3组肺部PRRSV阳性率分别20%、90%和100%,试验1组中阳性猪的肺部病毒载量也比试验2、3组显著低(P<0.05,图2-6);试验1组、试验2组和试验3组扁桃体PRRSV阳性率分别是60%、100%和100%,试验1组中阳性猪的扁桃体病毒载量也比试验2、3组显著低(图2-6);3)试验1组免疫和攻毒后至试验结束血清中都没有测到中和抗体,试验2组免疫后产生了微弱的中和抗体,但是攻毒10天(D38)后中和抗体明显升高,显著高于试验1组和3组(P<0.05),试验3组只是在试验结束时(D42)测到微弱的中和抗体(图2-7)。上述试验结果表明该灭活疫苗预防PRRSV(Lelystad)感染效果较差,优先选择MLV疫苗。


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图2-5 各组血清病毒载量几何均值

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图2-6 各组肺脏和扁桃体病毒载量

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图2-7 各组血清中和抗体滴度(SVN)


Nilubol D.等(2004)通过试验验证商品化的灭活疫苗(PRRomiSe®, Intervet, USA)在处理之前PRRSV感染猪的排毒影响,具体分组:试验1组不攻毒的对照组,试验2组灭活疫苗对照组,试验3组攻毒对照组,试验4组攻毒+14、28天灭活疫苗免疫两次,攻毒的组都是在0天鼻内接种1mL PRRSV VR-2385 105.4TCID50/mL(表2-3)。结果显示:病毒血症滴度和持续时间试验4组和试验3组无差异;所有攻毒猪只到21天都可以分离到病毒;尸体剖检时,试验3组扁桃体8/18可以分离到病毒,试验4组扁桃体6/15可以分离到病毒,但是PCR检测PRRSV RNA,试验3组和试验4组所有猪的扁桃体都是阳性。中和抗体结果:试验1组和试验2组整个试验阶段都没有中和抗体;试验3组和试验4组在攻毒后28天中和抗体达到较高水平,但是差异不显著,在42天差异显著(P<0.05)(图2-8)。该试验表明仔猪感染PRRSV之后免疫该灭活疫苗,虽然可以诱导更好的体液免疫水平,但是没有缩短病毒血症和组织排毒时间,对于防控PRRSV感染没有起到相应的作用。

表2-3 实验分组设计

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图2-8 各组对PRRSV VR-2385中和抗体平均值

蔡学辉等(2009)分别采用PRRSV CH-1R致弱疫苗株和HP-PRRSV灭活疫苗免疫40-45日龄仔猪,免疫接种后4周,用HP-PRRSV HuN-4强毒攻毒,攻毒后21天剖检,取主要器官作病理组织学观察和病毒抗原定位。结果显示临床症状:空白组猪生长发育良好;攻毒对照组外形消瘦,在攻毒后第2天即出现体温升高并持续至死亡,耳部发绀;HP-PRRSV灭活疫苗免疫组在攻毒后也出现体温升高、生长迟缓现象,在攻毒后14天和17天均有死亡;CH-1R弱毒苗免疫组攻毒后无明显变化。剖检观察:空白对照组无明显变化;攻毒对照组猪腹股沟淋巴结和颌下淋巴结出血肿大,肺脏有灶状出血,肝脏有坏死灶,肾脏淤血;HP-PRRSV灭活苗免疫组颌下淋巴结肿大有出血点,肠系膜淋巴结和腹股沟淋巴结肿大出血,扁桃体轻度潮红,肝脏有条状出血,肾表面有出血,脾萎缩;CH-1R弱毒苗免疫组腹股沟淋巴结肿大,肺轻微膨胀不全。组织抗原结果:HP-PRRSV灭活疫苗免疫攻毒后导致的病理变化和病毒抗原分布程度均明显高于CH-1R弱毒疫苗免疫组(表2-4)。该研究结果表明CH-1R弱毒疫苗对HuN-4强毒免疫保护效果好于HP-PRRSV灭活疫苗。

表2-4 PRRSV抗原免疫组化检测结果

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李福泉等(2021)对由ISA201VG和ISA70VG佐剂分别制备的2种NADC30-PRRSV SY株灭活疫苗的免疫效果进行比较研究。选用35日龄PRRSV抗体和抗原均为阴性的健康仔猪15头,随机分为3组:试验1组(ISA201VG免疫组)、试验2组(ISA70VG免疫组)和对照组(未免疫攻毒组)。试验组首免107.0TCID50/头,间隔21天后以相同剂量进行二次免疫,采用ELISA法检测PRRSV血清抗体,结果显示:免疫后第35天,试验2组的5头猪PRRSV抗体转阳率达100%,试验1组的5头猪PRRSV抗体转阳率达40%(图2-9)。二免后14天采用NADC30-PRRSV SY株攻击试验猪,攻毒剂量为1×105.0TCID50/mL,检测各组猪体温变化,结果显示:试验2组从攻毒后第8天起体温超过40℃,持续6天;试验1组的5头猪只有1头体温超过40℃;对照组5头猪攻毒后第11-13天体温升至40℃持续3天(图2-10)。各组猪增重检测显示:试验2组与对照组相比较,体重呈现负增长且体重减少均在5%以上,而试验1组与对照组相比较,体重呈现正增长且增长均在7%以上(图2-11)。对PRRSV感染后2个试验组肺组织病理观察均可见肺脏呈局限性间质性肺炎和淤血,并伴有血栓、部分肺泡隔增宽,支气管周围有淋巴细胞浸润伴有间质性肺炎,但试验2组比试验1组组织病变更加严重(表2-5)。本试验结果表明ISA201VG佐剂效果更好,同时证实类NADC30-PRRSV(SY株)制备的灭活疫苗对于同源毒株的攻毒保护较差,不宜制备灭活疫苗免疫。虽然该试验重点在讨论不同佐剂的效果,但是也显示了类NADC30-PRRSV(SY株)不宜制备灭活疫苗。

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图2-9 不同佐剂配制的PRRSV灭活疫苗接种猪后的抗体变化

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图2-10 类NADC30-PRRSV/SY株攻毒后各组猪的体温变化


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图2-11 类NADC30-PRRSV/SY株攻毒后各组猪的体重变化


表2-5 两种佐剂制备的PRRSV灭活疫苗免疫猪攻击NADC30-PRRSV/SY株后的组织

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Chaosi Li等(2022)试验研究了某商品化的弱毒活疫苗和两个不同灭活疫苗联合免疫仔猪的保护效力。具体试验分组(表2-6),4周龄免疫弱毒活疫苗,7周龄灭活疫苗加强免疫,10周龄104.5TCID50/mL NADC30-like攻毒(D0),12周龄(D15)解剖,采样检测。抗体检测结果:无论N蛋白抗体还是GP蛋白抗体,与单针免疫弱毒活疫苗(试验1组)相比,灭活疫苗的加强免疫(试验2组、试验3组)并不能提升抗体水平,没有激发记忆性体液免疫反应(图2-12)。发热情况:与阳性对照组相比,疫苗免疫组的发热天数和比例减少,而且差异极显著(P<0.001),但是疫苗免疫组之间统计学无显著差异(图2-13A)。临床评分:攻毒后第2天,除了阴性对照组,所有猪只都表现出不食、少食等临床症状,疫苗免疫组临床症状均结束于攻毒后第11天,但是阳性对照组试验结束时仍有咳嗽等临床症状(图2-13B)。肺脏大体病变和病毒载量:与阳性对照组相比,疫苗免疫组肺脏组织病毒滴度明显降低,而且差异极显著(P<0.001),但是单针免疫弱毒活疫苗和加强免疫灭活疫苗组在肺脏大体病变和病毒滴度上统计学没有显著差异(图2-14 A,B)。平均日增重:与阳性对照组相比,疫苗免疫组有极大改善,差异极显著;但是灭活疫苗加强免疫组和单针免疫弱毒活疫苗组统计学没有显著差异(图2-15)。该试验结果表明:弱毒活疫苗和灭活苗联合免疫程序中,灭活疫苗加强免疫没有激活记忆性体液免疫反应,没有降低肺组织中病毒载量,没有减轻肺脏大体病变,没有提升增重,所以对于本研究中NADC30-like攻毒不能提供更好的保护,同时表明:该PRRSV弱毒活疫苗对异源毒株只能提供部分保护,想通过用灭活苗加强免疫来提高效力,达不到目的;在灭活苗免疫之前,先用弱毒活苗做首免,结果差异不显著。

表2-6 实验分组及方案

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图2-12 抗体检测结果

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图2-13 各组体温和临床症状评分

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图2-14 各组肺脏眼观病变和病毒滴度

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图2-15 各组平均日增重

PRRSV毒株的快速变异导致毒株多样性,并且部分猪场存在多个谱系毒株共存的情况,增加了防控PRRS的难度,猪场为了稳定蓝耳病,选择使用弱毒疫苗和灭活疫苗联合使用,但是前面试验数据已经证实效果甚微。试验条件下或田间条件下,单纯使用灭活疫苗或者是之前感染过PRRSV的阳性猪群再使用灭活疫苗,对于减少排毒时间和排毒量以及提高生产成绩作用有限。

3 总结

综上所述,PRRSV灭活疫苗一般很难产生或者产生的中和抗体滴度较低,而且刺激产生的细胞因子反应一般也认为是佐剂的作用,属于非特异性免疫反应,大部分试验数据显示在预防PRRSV感染、减少排毒、提高生产成绩方面效果甚微。

也有文献报道,先免疫PRRS弱毒疫苗或者猪只感染过PRRSV之后,再免疫灭活疫苗,会激发更好的体液免疫和细胞免疫,这方面有正面的报道也有反面的报道,总体对防控PRRSV感染和减少排毒作用有限。

中国动物疫病预防控制中心制定的《2022年国家动物疫病免疫技术指南》指出,要科学合理选择PRRS灭活疫苗和活疫苗,在PRRS发病场或阳性不稳定场,可选择使用和本场流行毒株匹配的弱毒活疫苗,当前商品化弱毒活疫苗与类NADC30毒株亲缘关系较远,免疫后均无法阻止类NADC30毒株的感染,交叉保护不足,但疫苗免疫能一定程度上降低感染猪的病毒血症滴度,缩短排毒时间。

所以,PRRS防控需要综合措施,如生物安全、疫苗免疫、后备母猪隔离驯化和继发细菌疾病防控等,不能完全依赖疫苗免疫。目前很多种猪企业PRRSV净化提上日程,PRRSV灭活疫苗有一定的用武之地,可以在准备净化PPRSV的猪场稳定之后,种猪群免疫使用。


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