防非复产

猪伪狂犬病毒流行毒株体外中和抗体系列研究的启示

王科文 梁培新等

2011年以后,从北到南,我国多数养猪地区的许多原本伪狂犬病(Pseudorabies, PR)阴性的猪场逐渐转阳。随后有研究表明,本次流行的伪狂犬病毒(Pseudorabies virus, PRV)毒株相对经典毒株(SC株)而言,多个基因有较大的差异,毒力也更强,且现有的商品化疫苗对其感染的保护力相对更差[1](通过羊的免疫攻毒试验)。中和抗体作为评估疫苗免疫保护水平的一个重要指标,引起了一些养猪企业和科研院所的研究兴趣,他们对不同品牌的PRV疫苗免疫后诱导猪体产生新流行毒株中和抗体的水平及特点展开了一系列的研究。本文将简要介绍三个有代表性的该类研究成果,也将分享此系列研究给我们带来的一些启示,以增进大家对目前不同品牌PRV疫苗对流行毒株感染保护情况及近年来PR流行特点的了解,希望能给各位养猪同仁在疫苗选择及不同感染类型猪场综合防控方面提供一些借鉴。

1 不同品牌的PRV疫苗免疫诱导流行毒株中和抗体水平的系列研究

PRV为伪狂犬病的致病病原,猪是其唯一的自然宿主,可以导致猪只发生潜伏感染、亚临床感染以及致死性感染,临床的表现和感染的毒株、感染年龄、感染的途径、感染量以及免疫保护水平等多因素有关。长时间以来,免疫作为控制PR的有效方式被业内人士充分认可,它能够提高猪只的感染阈值、减少临床问题的发生、缩短攻毒后排毒时间和减少排毒量并能减少攻毒后潜伏感染猪的排毒等,但是,免疫往往不能完全阻止PRV的感染。在减少感染方面,细胞免疫起着重要作用,但要阻止感染,往往需要良好的细胞免疫和体液免疫(中和抗体)协同作用。无论是阻止猪只感染,还是感染后减少临床问题以及缩短排毒时间和减少排毒量,中和抗体都起着非常重要的作用。但是,近年来随着PRV新流行毒株在全国范围内的流行,有研究机构认为,目前使用的Bartha-K61株疫苗免疫诱导的针对流行毒株的中和抗体水平相对以前的经典毒株更差了,一些养猪企业和科研院所为了更清楚地了解目前不同品牌Bartha-K61株疫苗诱导产生新流行毒株中和抗体水平的差异和特点进行了一些研究。

1.1 不同品牌的PRV疫苗免疫诱导流行毒株中和抗体水平差异性的研究

2014年,广东源丰农业有限公司选择了4种著名的、不同品牌的PRV疫苗,分母猪和生长猪2个不同群体进行了试验。

母猪试验:该场共有约5000头基础母猪,分多条生产线饲养。选择其中一条约1000头的生产线免疫P苗(硕腾公司“扑伪佳”,疫苗株为Bucharest株),另一条约1200头的生产线免疫F苗(硕腾公司“清伪灵”,疫苗株为Bartha-K61株),其余生产线全部免疫M苗(某进口品牌,疫苗株为Bartha-K61株)。在该次分组免疫之前的6个月,全场母猪免疫的都是M苗。在分组免疫后的6个月,从M、P、F三个试验组分别随机抽取10头、10头、14头母猪的血清用PRV流行毒株(HuBei株)做中和试验。在进行中和试验之前,检测了这34个样品的gE抗体,结果均为阴性。中和试验结果如表1-1,组内样品按中和抗体效价从高往低排列。为了更直观地表示抗体水平的高低,本试验用能够中和病毒的最高血清稀释倍数来表示样品的中和抗体水平,例如,血清抗体值为“8”,则表示该血清的中和抗体效价为1:8。

表1-1 M、P、F苗试验组母猪免疫疫苗6个月后的中和试验结果

M苗免疫组

P苗免疫组

F苗免疫组

抗体值

数量

抗体值

数量

抗体值

数量

32

1

64

1

256

2

16

1

16

5

64

5

8

3

8

3

32

2

4

4

4

1

16

3

2

1



8

2

2-4倍:50%

8-16倍:40%

32-64倍:10%

几何平均值:6.5

2-4倍:10%

8-16倍:80%

32-64倍:10%

几何平均值:13

8-16倍:35.7%

32-64倍:50%

128-256倍:14.3%

几何平均值:39

生长猪试验:生长猪免疫试验分为4组进行,每组10头猪,分别免疫M、P、B和F等不同品牌的PRV疫苗(M、P、F苗同母猪试验疫苗,B苗为另一种进口品牌的PRV疫苗,疫苗株也是Bartha-K61株)。免疫程序:11周龄首免,15周龄二免。试验猪只全部来源于同一生产线同一批次。第二次免疫5周后收集血清用PRV流行毒株(HuBei株)做血清中和试验,试验结果见表1-2。

表1-2 各试验组生长猪免疫2次疫苗后5周的中和试验结果

M苗免疫组

P苗免疫组

B苗免疫组

F苗免疫组

抗体值

数量

抗体值

数量

抗体值

数量

抗体值

数量

8

1

4

2

16

1

8

1

4

1

0

8

8

1

4

2

2

1



2

1

2

5

0

7



0

7

0

2

30%有中和抗体

几何平均值:1.52

20%有中和抗体

几何平均值:1.32

30%有中和抗体

几何平均值:1.74

80%有中和抗体

几何平均值:2.30

由表1-1、1-2可知,无论是在母猪试验还是在生长猪试验中,不同品牌的PRV疫苗免疫诱导猪只产生的流行毒中和抗体水平差异显著。在本研究中“清伪灵”免疫诱导猪体产生的流行毒中和抗体的能力明显优于其它3个著名疫苗。另外,同样的疫苗免疫母猪后诱导产生的中和抗体水平要比生长猪优秀得多,M、P、B品牌的PRV疫苗2次免疫生长猪后中和抗体阳性率都只在20~30%之间,而且中和抗体平均值不超过2倍。一般认为中和抗体值超过2倍即可提供临床保护力,而“清伪灵”免疫2次后5周,中和抗体阳性率为80%,平均值为2.30,为4个疫苗试验组最高的。那么为什么用同样毒株生产的PRV疫苗免疫诱导的流行毒中和抗体水平相差如此之大?笔者认为可能和疫苗毒传代代次、培养细胞、抗原含量、抗原质量及佐剂等多个因素有关。

1.2 不同品牌的PRV疫苗免疫诱导的流行毒株中和抗体和gB抗体相关性的初步研究

为方便起见,我们常常通过ELISA检测gB抗体来评估疫苗免疫后的效果。一般来说,gB抗体水平越高,中和抗体水平会越高,但是,流行毒株出现,gB基因的一些位点发生变异以后,这种gB-ELISA的抗体水平和流行毒的中和抗体水平仍然具有强烈的正相关性吗?

2013年4~6月,浙江省农业科学院畜牧兽医研究所在研究不同品牌疫苗诱导流行毒的中和抗体能力的同时,研究了gB抗体和流行毒(未命名毒株)中和抗体的关系。他们把来自常规商品猪场的73头10周龄gE抗体阳性(临床健康,应该是母源抗体)的仔猪分成6组(A、B、C、D、E、F),不同的试验组分别用1种不同的PRV疫苗免疫1头份,免疫后30天,检测每头试验猪的gB-ELISA抗体和流行毒的中和抗体,检测结果见表1-3。

表1-3 不同试验组免疫疫苗30天后的gB抗体均值和中和抗体值大于10的样本比例

疫苗组别

试验猪数(头)

gB抗体S/N均值

中和抗体值大于10的样本比例

A

12

0.37

25%(3/12)

B

11

0.21

27.3%(3/11)

C

12

0.25

50 % ( 6/12)

D

13

0.25

53.8%  (7/13)

E

13

0.48

61.5%  (8/13)

F

12

0.23

66.7%  (8/12)

注:1、E组所用疫苗为硕腾公司的“清伪灵”;2、本试验所用ELISA为阻断ELISA,S/N值和gB抗体值成反比。

由表1-3可知,目前商品化疫苗诱导生长猪产生的流行毒中和抗体水平都不太高,但是差异很大,A疫苗诱导产生的中和抗体值最低,大于10的样本比例为3/12,“清伪灵”和F疫苗诱导猪只产生的中和抗体水平最好(中和抗体值大于10的样本超过60%)。另外,也可以看到,诱导gB抗体最好的B疫苗诱导的中和抗体并不好,中和抗体值大于10的样本比例才3/11。本试验中“清伪灵”的gB-ELISA抗体并不是很好(S/N均值为0.48,但在其未发表的另一项研究中,其它条件不变,只是试验猪由本试验的gE抗体阳性猪换成使用gE抗体阴性猪,各疫苗免疫组免疫30天后检测gB-ELISA和中和抗体,结果是“清伪灵”免疫组gB抗体和中和抗体水平都最高),但其中和抗体值大于10的样本比例相对更好。这些似乎说明,gB抗体和目前流行毒的中和抗体相关性不强,单纯通过检测gB抗体水平的高低来评估疫苗免疫后的保护水平高低不合理。

1.3 母源流行毒株中和抗体衰减规律的研究

2014年7~10月,广东中山市白石猪场有限公司为了验明PRV疫苗免疫产生的母源抗体对仔猪的保护规律,进行了仔猪母源流行毒株中和抗体衰减规律的跟踪试验。他们在本场(伪狂犬病阴性场)选择了10头母猪,其中5头猪为高中和抗体水平,另5头猪为低中和抗体水平。这10头母猪的分娩时间是疫苗免疫后2个月,在此之前,母猪的免疫程序为免疫某进口品牌疫苗(Bartha-K61株),间隔4个月免疫1次。每头母猪所产仔猪各选2头,共20头,13周龄之前不予免疫,打上标记,每隔7天收集血样一次,一直到13周龄,用流行毒株(Hubei株)做血清中和试验,结果见图1-1。 

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图1-1 不同周龄猪只母源流行毒株(Hubei株)中和抗体的几何平均值

由图1-1可知,母猪经过多次免疫后,所产仔猪可通过初乳获得母源抗体,13周龄时仍然有针对流行毒的中和抗体,但10周龄之后抗体值即降到2倍以下。另外,该试验验证了母源抗体的半衰期为14天,从4周龄(断奶时)到10周龄,大约每隔两周抗体衰减一半左右,规律较为明显。1~3周龄抗体衰减无明显规律,可能和奶水质量及健康状况等有关。11~13周龄抗体值低于2倍,有大部分样品属于阴性,也没表现出衰减规律。该研究结果意味着,临床上可以通过测定断奶后、10周龄前某个时间点的中和抗体效价,按照2周半衰期的规律来推算首免日龄。首免日龄通常还需根据猪群的感染压力来确定计划免疫时能接受的中和抗体值来推算,不同的感染压力下免疫时能接受的中和抗体值有差异。感染压力小的猪群,免疫时可以设定较低的中和抗体值,反之,则需较高值。例如,如果根据感染压力,计划设定首免时间点在中和抗体值为4倍时,同时,28日龄的中和抗体值为32倍,则首免日龄为:28+(lg225- lg222)×14=70日龄。当然,确定免疫时间时还需考虑是否存在母源抗体的影响。

2 流行毒株中和抗体系列研究的启示

2.1 有助于认识不同品牌的PRV疫苗对流行毒株感染的保护水平和选择合格的疫苗

同样疫苗毒株不同品牌的PRV疫苗免疫后诱导的流行毒株中和抗体水平差异大。从表1-1、表1-2都可以看到,同样疫苗毒株(Bartha-K61毒株)的传统疫苗,M疫苗免疫母猪6个月后的中和抗体值没有超过16倍的,而F疫苗(“清伪灵”)免疫母猪6个月后的中和抗体值在16倍以上的超过64%。另外,生长猪免疫也有一定差异,Bartha-K61毒株疫苗(M、B)免疫生长猪2次后才有30%的猪具有流行毒的中和抗体,而同样毒株的F苗(“清伪灵”)免疫生长猪2次后有80%的猪具有流行毒中和抗体,而且抗体平均值要明显高于其他疫苗组。通过1.1的研究都可以看到“清伪灵”免疫组不但中和抗体均值相对高,而且中和抗体值相对均匀,组内差异小。

同一种疫苗免疫母猪和生长猪诱导的中和抗体水平差异很大。由1 中的研究可知,无论是在母猪还是在生长猪免疫中诱导中和抗体表现相对最好的“清伪灵”,还是表现更差的M和P疫苗,都表现出这种明显特征,这似乎和母猪本身的免疫系统更为健全以及母源抗体干扰免疫有关。

不同品牌的PRV疫苗免疫诱导的流行毒中和抗体和gB-ELISA抗体无明显相关性(由1.2的研究知),以前通过gB-ELISA抗体水平来评估疫苗免疫效果的方法需要做进一步的认证。

疫苗抗原含量高并不意味着诱导的中和抗体水平高。上述1.1研究中的M进口疫苗的抗原标识含量是最高的,但是无论是在母猪免疫还是在生长猪免疫中它诱导的流行毒中和抗体水平都不是最高的,都比抗原标识含量稍低的“清伪灵”差。

2.2 有助于理解近年PR的主要流行特点

王科文等[2]分析了大量的田间PR案例后,归纳出本次PR大面积流行的三个主要特点:高水平的gB-ELISA抗体没能阻止猪群快速转阳、猪场开始转阳时往往先发生在育肥猪阶段(育肥猪群往往是命门)、转阳场临床情况差异很大。上述的中和抗体系列研究成果有助于我们进一步理解这三个流行特点。

由1.2 的研究结果可知,C组和D组具有较高的gB抗体水平,但是其中和抗体水平并不是很高,特别是B组具有最高的gB抗体水平,但是其中和抗体水平却是很低的,E组中和抗体水平相对较高,但其gB抗体水平却是最差的。所以,许多情况下,gB抗体水平高的猪只并不一定具备高水平的中和抗体,难怪有些具有高水平gB抗体的猪群也会快速转阳。

1.1 和1.2 的研究结果都表明,生长猪,特别是10周龄以后的生长猪中和抗体水平相对母猪都低得多,特别是1.1 的研究成果表明,M、P、B疫苗2次免疫后仍有70%或以上的猪只根本没有流行毒的中和抗体。1.3的研究中,更明确地显示母源中和抗体在70日龄以后已经很低了(当然,这和母猪群整体的中和抗体水平有关,免疫效果更好的母猪群可以有更高、更均匀的母源抗体)。再加上育肥猪群的猪比较多、育肥时间较长等会导致感染压力增大的因素普遍存在,育肥猪群很显然相对母猪、哺乳仔猪、保育仔猪的感染风险要高得多。

尽管中和抗体不能阻止PRV感染,但是,对减少临床问题和损失的作用是明显的。同样由上述的研究结果可知,多数疫苗免疫生长猪后诱导的流行毒中和抗体水平很低,甚至没有。在实际生产中,有的疫苗(如1.1研究中的M苗)免疫母猪后诱导的针对流行毒的中和抗体水平都不高。这种情况下,一旦感染压力增大,临床上就容易出现明显损失。

2.3 有助于针对目前不同感染类型的猪场选择有效的控制策略

我们通常根据PRV流行毒株的感染类型把猪场分为四类:第一类场,阴性猪场或还没有感染流行株的阳性场;第二类场,爆发或急性感染流行株的猪场,这类场感染后临床情况差异很大,有的场临床损失不明显,只是血清转阳,有的损失很大,育肥猪可达5%以上的死淘率、母猪可发生10%以上的流产、哺乳仔猪可发生100%的死亡;第三类场,流行毒株急性感染后临床基本稳定的阳性猪场,这类场母猪群阳性,如果没有合适的措施,育肥猪群很长时间内也是阳性,只是不同场、不同批次育肥猪群转阳的时间和程度不同,但临床上可无明显因伪狂犬病导致的损失;第四类场,母猪群阳性稳定、育肥猪群已转阴性的猪场。这四类猪场是可以转换的,其转换的常见顺序见图2-1。一般来讲,第二类猪场,如无其它复杂因素影响,在2~3个月之内,会自动转变为第三类猪场;第三类猪场,是感染类型最多的猪场,如没有针对性的有效措施不会自动变为第四类猪场,是持续时间最长的一类猪场,是需要重点关注的一类猪场;第四类猪场,该类场已经初步具备转阴的条件(转化为第一类猪场的条件),但是,如果不注意,又可以变为第三类猪场。

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图2-1 四类不同感染类型猪场的常见转化顺序

2.3.1 阴性场

根据笔者的田间观察,大部分阴性猪场转阳的传染源来自于引进的阳性猪(多为阳性后备种猪),再结合2.2的内容可以知道,对于猪场而言,育肥猪群通常是伪狂犬病的“命门”。针对这类猪场,一方面,要关注生物安全,特别是关注引进后备种猪的隔离、检测,杜绝引进PR阳性猪;另一方面,应合理安排本类猪场的免疫,本类猪场一般没有必要进行滴鼻和早期免疫,应将免疫资源更多地倾向于生长猪群,有条件的场应视周边的感染压力来加强生长猪群的免疫,一般可采用10周龄和14~16周龄各免疫一次 “清伪灵”的免疫程序。

2.3.2 爆发感染PRV流行毒株的猪场

爆发PR的猪场,如果没有尽快控制,PRV感染压力将迅速增大,除了育肥猪群本身可能导致损失外,还将会迅速扩散至免疫后抵抗力相对较好的母猪群和仔猪群(由1.1 和1.3的研究可知)。针对这类猪群,应尽早诊断后并采取快速、坚决的隔离及淘汰措施,但多数情况下,往往诊断滞后,等诊断明确时,本病已经扩散至母猪或仔猪群。针对这类猪场,要重点对育肥猪群、母猪群进行加强免疫(由1.1的研究可知,不同疫苗免疫诱导的母猪群中和抗体水平差异很大,同样的疫苗免疫不同母猪,抗体水平差异也很大)和对新生仔猪进行滴鼻免疫,来减少猪群的排毒量和临床损失,促使猪群尽快稳定。

2.3.3 爆发感染流行毒株后,临床基本稳定的阳性猪场

无其它问题,第二类猪场母猪群感染流行毒株后,进行加强免疫,将于2~3个月之内转变为本类猪场。本类猪场临床上基本稳定,很少有和PRV相关的繁殖障碍及新生仔猪的损失(偶尔相关的繁殖障碍和新生仔猪发病应考虑免疫措施是否合理等问题),但是,PRV会长时间在育肥猪群循环(由1.1、1.2、1.3的研究可推知),导致育肥猪群不同程度的临床损失,单点生产的猪群也会导致种猪群、仔猪群感染压力增大。这类猪群会长期存在,危害极大,更新的阴性后备种猪转阳的几率会很高。

本类猪场的工作重点是在尽量短的时间内,尽可能大幅度地降低育肥阶段的野毒阳性率(野毒阳性率降低,感染压力就下降)。猪群大小、生产方式、生物安全措施、疫苗种类、免疫强度、免疫程序等因素会影响育肥猪群的野毒阳性率下降程度和速度。为了尽快降低育肥猪群的野毒阳性率,选择能诱导机体产生相对高水平中和抗体的疫苗是基础,同时,要加强生长猪的免疫力度来提高中和抗体的水平,从而减少感染猪的排毒量和排毒时间。母猪群可以免疫4次/年,生长猪群的免疫,原则上,免疫程序应根据母源中和抗体的衰减规律和本猪群内病毒活跃的时间来确定免疫时间。多数情况下,可选择6~9周龄、10~13周龄各免疫一次“清伪灵”,对于有意向更快减小猪群感染压力的猪场,可以选择17~20周龄再加强免疫一次。少数本类猪场,在初期(爆发稳定后3~4月个内)或感染压力很大的情况下(20周龄以上育肥猪野毒阳性率在60% 以上),如果担心母猪群免疫不理想和母猪本身健康水平差异大而影响仔猪的母源抗体水平,可以考虑对新生仔猪进行滴鼻免疫(绝大多数情况下无必要)。这两年以来,已经有不少该类猪场通过加强“清伪灵”的免疫和配合其它饲养管理措施,转化成了第四类猪场(最快的甚至不到半年就将野毒阳性率为80% 以上的育肥猪群的阳性率降为0%)。

本类猪场应该定期(大多为每4~6个月)追踪20周龄以后育肥阶段野毒阳性率的下降情况,并根据下降情况和转阳时间调整免疫时间和管理措施。另外,1~2次检测的育肥阶段野毒抗体阳性率为0%,并不能说明育肥猪阶段没有病毒循环而属于第四类猪场,只是育肥猪阶段的野毒阳性率很低。如果没能进一步巩固,育肥猪群阳性率又有可能上升,从而又使整个猪群感染压力加大。

2.3.4 母猪群阳性,育肥猪已经转阴的猪场

本类猪场的感染压力已经大幅度下降,通过引进阴性的后备种猪来更新阳性种猪群,效率会比第三类猪场高得多,更新的阴性后备种猪转阳的几率要小得多。但是,因为母猪本身情况的复杂性,病毒还是会在阳性的母猪群低水平的循环(影响多在免疫反应层面,很少导致临床问题)。

本类猪场的工作重点,一方面,根据猪场自身情况,不同强度地更新阴性后备种猪和淘汰野毒抗体阳性的种猪(时间越短、更新的强度越大,清除本病的速度会越快);另一方面,仍应像第一类猪场那样,重视生物安全和生长育肥猪的免疫工作,避免其回到第三类或第二类猪场。

3 总结

由上述系列研究结果可知,目前普遍使用的PRV疫苗免疫后诱导猪体产生的流行毒株中和抗体水平差异很大,大部分疫苗免疫后不能诱导猪只产生良好的流行毒中和抗体,gB-ELISA抗体和中和抗体的相关性也不明显,“清伪灵”在诱导流行毒株的中和抗体水平上,表现相对突出。猪场可以根据本场PRV的感染状态,合理运用“清伪灵”免疫,配合合理的生产流程、严格的生物安全等措施来控制伪狂犬病,为清除伪狂犬病打下基础。

参考文献

[1] Y. Luo et al., Pathogenicity and genomic characterization of a pseudorabies virus variant isolated from Bartha-K61-vaccinated swine population in China. Veterinary Microbiology, 2014, 174 (1~2): 107~115

[2] 王科文等. 现阶段我国猪伪狂犬病的控制重点探讨. 养猪, 2014(3): 89~90

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